በ PCR ምላሾች ውስጥ ጣልቃ-ገብነት ምክንያቶች

በ PCR ምላሽ ወቅት, አንዳንድ ጣልቃ-ገብ ምክንያቶች ብዙ ጊዜ ያጋጥሟቸዋል.
በጣም ከፍተኛ በሆነ የ PCR ስሜታዊነት ምክንያት, ብክለት PCR ውጤቶችን ከሚነኩ በጣም አስፈላጊ ነገሮች አንዱ እንደሆነ እና የውሸት አወንታዊ ውጤቶችን ሊያመጣ ይችላል.
ወደ ሐሰት-አሉታዊ ውጤቶች የሚመሩ የተለያዩ ምንጮች እኩል ወሳኝ ናቸው። አንድ ወይም ከዚያ በላይ አስፈላጊ የሆኑ የ PCR ድብልቅ ክፍሎች ወይም የማጉላት ምላሽ እራሱ ከተከለከሉ ወይም ከተደናቀፈ የምርመራው ምርመራ ሊታገድ ይችላል። ይህ ወደ ቅልጥፍና መቀነስ እና እንዲያውም የውሸት አሉታዊ ውጤቶችን ሊያስከትል ይችላል.
ከመከልከል በተጨማሪ የናሙና ዝግጅት ከመደረጉ በፊት በማጓጓዣ እና/ወይም በማከማቻ ሁኔታዎች ምክንያት የታለመው የኑክሊክ አሲድ ታማኝነት መጥፋት ሊከሰት ይችላል። በተለይም ከፍተኛ ሙቀት ወይም በቂ ያልሆነ ማከማቻ በሴሎች እና ኑክሊክ አሲዶች ላይ ጉዳት ሊያደርስ ይችላል። የሕዋስ እና የቲሹ ጥገና እና ፓራፊን መክተት የዲኤንኤ መበታተን እና የማያቋርጥ ችግር መንስኤዎች ናቸው (ምስል 1 እና 2 ይመልከቱ)። በነዚህ ሁኔታዎች, ጥሩው ማግለል እና ማጽዳት እንኳን አይረዳም.

ምስል 1 | በዲ ኤን ኤ ትክክለኛነት ላይ የማይንቀሳቀስ ውጤት
Agarose gel electrophoresis እንደሚያሳየው የዲኤንኤው ጥራት ከፓራፊን የአስከሬን ክፍሎች ተለይቶ በከፍተኛ ደረጃ ይለያያል። የተለያየ አማካይ ቁርጥራጭ ርዝመት ያለው ዲ ኤን ኤ በማስተካከል ዘዴው ላይ በመመርኮዝ በቅንጦቹ ውስጥ ተገኝቷል። ዲ ኤን ኤ የሚጠበቀው በተቀዘቀዙ ናሙናዎች እና በገለልተኛ ፎርማሊን ውስጥ ሲስተካከል ብቻ ነው። ጠንካራ አሲዳማ የሆነ የ Bouin fixative ወይም unbuffered ፎርሚክ አሲድ ያለው ፎርማሊን መጠቀም ከፍተኛ የዲኤንኤ መጥፋት አስከትሏል። የተቀረው ክፍልፋይ በጣም የተከፋፈለ ነው.
በግራ በኩል፣ የቁራጮቹ ርዝመት በኪሎቤዝ ጥንዶች (kbp) ይገለጻል።

ምስል 2 | የኒውክሊክ አሲድ ዒላማዎች ታማኝነት ማጣት
(ሀ) በሁለቱም ክሮች ላይ ያለው የ3′-5′ ክፍተት በታለመው ዲኤንኤ ላይ መቋረጥን ያስከትላል። የዲኤንኤ ውህደት አሁንም በትንሽ ቁራጭ ላይ ይከሰታል. ነገር ግን፣ በዲ ኤን ኤ ክፍልፋይ ላይ የፕሪመር ማስታገሻ ቦታ ከጠፋ፣ መስመራዊ ማጉላት ብቻ ነው የሚከሰተው። በጣም ምቹ በሆነ ሁኔታ, ቁርጥራጮቹ እርስ በእርሳቸው እንደገና ሊዋሃዱ ይችላሉ, ነገር ግን ምርቶቹ ትንሽ እና ከመለየት ደረጃ በታች ይሆናሉ.
(ለ) የመሠረት መጥፋት, በዋነኝነት በዲፕዩሪኔሽን እና በቲሚዲን ዲመር መፈጠር ምክንያት, የ H-bonds ብዛት መቀነስ እና የቲኤም መቀነስን ያመጣል. በተራዘመው የሙቀት ደረጃ ላይ፣ ፕሪመርሮቹ ከማትሪክስ ዲ ኤን ኤ ይቀልጣሉ እና በትንሽ ጥብቅ ሁኔታዎች ውስጥ እንኳን አይጠፉም።
(ሐ) አጎራባች የቲሚን መሰረቶች የቲቲ ዲመር ይፈጥራሉ።
በሞለኪውላር ምርመራ ላይ ብዙ ጊዜ የሚከሰት ሌላው የተለመደ ችግር ከፋይኖል-ክሎሮፎርም ኤክስትራክሽን ጋር ሲነፃፀር የዒላማ ኑክሊክ አሲዶች ከትክክለኛው ያነሰ መለቀቅ ነው። በአስጊ ሁኔታ ውስጥ, ይህ ከሐሰት አሉታዊ ነገሮች ጋር ሊዛመድ ይችላል. ብዙ ጊዜ ሊሲስ ወይም የሕዋስ ፍርስራሾችን ኢንዛይማቲክ መፈጨትን ማትረፍ ይቻላል፣ ነገር ግን ይህ ዘዴ ብዙውን ጊዜ በቂ የኒውክሊክ አሲድ መለቀቅ ባለመቻሉ ዝቅተኛ የ PCR ስሜትን ያስከትላል።

በማጉላት ጊዜ የ polymerase እንቅስቃሴን መከልከል

በአጠቃላይ፣ መከልከል ወደ ንዑስ PCR ውጤቶች የሚመራውን ሁሉንም ምክንያቶች ለመግለጽ እንደ መያዣ ጽንሰ-ሀሳብ ጥቅም ላይ ይውላል። በጥብቅ ባዮኬሚካላዊ ትርጉም፣ መከልከል በኢንዛይም እንቅስቃሴ ላይ ብቻ የተገደበ ነው፣ ማለትም፣ ከዲኤንኤ ፖሊመሬሴ ወይም ከኮፋክተሩ (ለምሳሌ Mg2+ ለ Taq DNA polymerase) ከገባበት ቦታ ጋር በመገናኘት የንዑስ-ምርት ለውጥን ይቀንሳል ወይም ይከለክላል።
በናሙናው ውስጥ ያሉ አካላት ወይም የተለያዩ ቋት እና ሪጀንቶች የያዙ ተዋጽኦዎች ኢንዛይሙን በቀጥታ ሊገቱ ወይም ተባባሪዎቹን (ለምሳሌ EDTA) በማጥመድ ፖሊመሬሴን በማነቃቀል እና ወደ መቀነስ ወይም የውሸት አሉታዊ PCR ውጤቶች ሊመሩ ይችላሉ።
ነገር ግን፣ በምላሽ አካላት እና ዒላማ ባላቸው ኑክሊክ አሲዶች መካከል ያሉ ብዙ መስተጋብር እንደ 'PCR አጋቾቹ' ተወስኗል። የሴሉ ታማኝነት በተናጥል ከተረበሸ እና ኑክሊክ አሲድ ከተለቀቀ በኋላ በናሙና እና በአካባቢው መፍትሄ እና በጠንካራ ደረጃ መካከል ያሉ ግንኙነቶች ሊፈጠሩ ይችላሉ. ለምሳሌ፣ 'scavengers' ነጠላ ወይም ባለ ሁለት ገመድ ዲ ኤን ኤ ኮቫለንት ባልሆኑ ግንኙነቶች ማሰር እና ከጊዜ በኋላ ወደ PCR ምላሽ መርከብ የሚደርሱትን ኢላማዎች በመቀነስ ማግለል እና ማጽዳት ላይ ጣልቃ መግባት ይችላሉ።
በአጠቃላይ, PCR አጋቾቹ በአብዛኛዎቹ የሰውነት ፈሳሾች እና ለክሊኒካዊ የምርመራ ሙከራዎች (ዩሪያ በሽንት, ሄሞግሎቢን እና ሄፓሪን በደም ውስጥ), የአመጋገብ ማሟያዎች (ኦርጋኒክ ክፍሎች, glycogen, fat, Ca2+ ions) እና በአካባቢ ውስጥ ያሉ አካላት (phenols) ውስጥ ይገኛሉ. ከባድ ብረቶች)

በይበልጥ የተስፋፉ PCR አጋቾች በባክቴሪያ እና eukaryotic cells፣ ኢላማ ያልሆኑ ዲ ኤን ኤ፣ የዲኤንኤ ትስስር ያላቸው የቲሹ ማትሪክስ እና የላብራቶሪ መሳሪያዎች እንደ ጓንት እና ፕላስቲኮች ይገኛሉ። የ PCR አጋቾቹን ለማስወገድ ተመራጭ ዘዴ በሚወጣበት ጊዜ ወይም በኋላ ኑክሊክ አሲዶችን ማፅዳት ነው።
ዛሬ፣ የተለያዩ አውቶሜትድ የማውጫ መሳሪያዎች ብዙ የእጅ ፕሮቶኮሎችን ሊተኩ ይችላሉ፣ ነገር ግን 100% ማገገም እና/ወይም ኢላማዎችን ማጥራት በጭራሽ አልተሳካም። እምቅ መከላከያዎች አሁንም በተጣራ ኑክሊክ አሲዶች ውስጥ ሊኖሩ ይችላሉ ወይም ቀድሞውኑ ተፈጻሚ ሊሆኑ ይችላሉ. የአጋቾችን ተጽእኖ ለመቀነስ የተለያዩ ስልቶች አሉ. ተገቢው የፖሊሜራዝ ምርጫ በአነቃቂ እንቅስቃሴ ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል. PCR መከልከልን ለመቀነስ ሌሎች የተረጋገጡ ዘዴዎች የ polymerase ትኩረትን መጨመር ወይም እንደ BSA ያሉ ተጨማሪዎችን መተግበር ናቸው።
የ PCR ምላሾችን መከልከል የውስጣዊ ሂደትን የጥራት ቁጥጥር (አይፒሲ) በመጠቀም ማሳየት ይቻላል.
እንደ ኢታኖል፣ EDTA፣ CETAB፣ LiCl፣ GuSCN፣ SDS፣ isopropanol እና phenol ያሉ ሁሉንም ሬጀንቶችን እና ሌሎች መፍትሄዎችን በኤታኖል፣ ኤስዲኤ፣ አይሶፕሮፓኖል እና ፌኖል ውስጥ ከኒውክሊክ አሲድ ለይቶ በማጠብ በጥንቃቄ ማስወገድ ያስፈልጋል። እንደ ትኩረታቸው መጠን PCR ን ማግበር ወይም መከልከል ይችላሉ።