በ PCR ግብረመልሶች ውስጥ ጣልቃ ገብነት ምክንያቶች

በ PCR ምላሽ ወቅት፣ አንዳንድ ጣልቃገብ ምክንያቶች ብዙውን ጊዜ ይከሰታሉ።
በPCR ከፍተኛ ስሜታዊነት ምክንያት፣ ብክለት የPCR ውጤቶችን ከሚነኩ በጣም አስፈላጊ ነገሮች አንዱ እንደሆነ ተደርጎ ይቆጠራል እና የተሳሳቱ አዎንታዊ ውጤቶችን ሊያስከትል ይችላል።
ወደ ሐሰት-አሉታዊ ውጤቶች የሚያመሩ የተለያዩ ምንጮች እኩል ወሳኝ ናቸው። አንድ ወይም ከዚያ በላይ አስፈላጊ የPCR ድብልቅ ክፍሎች ወይም የማጉላት ምላሽ ራሱ ከተከለከሉ ወይም ከተስተጓጎሉ የምርመራ ምርመራው ሊደናቀፍ ይችላል። ይህ ወደ ቅልጥፍና መቀነስ እና እንዲያውም የውሸት አሉታዊ ውጤቶችን ሊያስከትል ይችላል።
ከቁጥጥር በተጨማሪ፣ የናሙና ዝግጅት ከመደረጉ በፊት በማጓጓዣ እና/ወይም በማከማቻ ሁኔታዎች ምክንያት የታለመው የኒውክሊክ አሲድ ታማኝነት መጥፋት ሊከሰት ይችላል። በተለይም፣ ከፍተኛ የሙቀት መጠን ወይም በቂ ያልሆነ ማከማቻ የሴሎችን እና የኒውክሊክ አሲዶችን ጉዳት ሊያስከትል ይችላል። የሴል እና የቲሹ ጥገና እና የፓራፊን መክተት የዲኤንኤ መበታተን እና የማያቋርጥ ችግር መንስኤዎች ናቸው (ምስል 1 እና 2 ይመልከቱ)። በእነዚህ አጋጣሚዎች፣ ምርጥ ማግለል እና ማጽዳት እንኳን አይረዱም።

ምስል 1 | የእንቅስቃሴ መቆም በዲኤንኤ ትክክለኛነት ላይ የሚያሳድረው ተጽዕኖ
የአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፎረሲስ እንደሚያሳየው ከፓራፊን የአስክሬን ምርመራ ክፍሎች የተነጠለው የዲኤንኤ ጥራት በእጅጉ ይለያያል። የተለያዩ አማካይ የክፍልፋይ ርዝመት ያላቸው ዲኤንኤዎች በማጣሪያ ዘዴው ላይ በመመስረት በምርቶቹ ውስጥ ይገኙ ነበር። ዲኤንኤ የሚጠበቀው በአገር ውስጥ በተቀዘቀዙ ናሙናዎች እና በተጠባባቂ ገለልተኛ ፎርማሊን ውስጥ ሲስተካከል ብቻ ነው። ጠንካራ አሲድ ያለው የቡዊን ፊክአቲቭ ወይም ያልተገደበ፣ ፎርሚክ አሲድ የያዘ ፎርማሊን መጠቀም ከፍተኛ የዲኤንኤ መጥፋት አስከትሏል። የቀረው ክፍልፋይ በከፍተኛ ሁኔታ የተበታተነ ነው።
በግራ በኩል፣ የቁርጥራጮቹ ርዝመት በኪሎቤዝ ጥንዶች (kbp) ይገለጻል

ምስል 2 | የኒውክሊክ አሲድ ኢላማዎች ታማኝነት ማጣት
(ሀ) በሁለቱም ክሮች ላይ ከ3′-5′ ክፍተት መኖሩ የታለመውን ዲኤንኤ መሰባበርን ያስከትላል። የዲኤንኤ ውህደት አሁንም በትንሽ ክፍልፋይ ላይ ይከሰታል። ሆኖም፣ በዲኤንኤ ክፍልፋይ ላይ የፕሪመር አኔይሊንግ ቦታ ከጠፋ፣ መስመራዊ ማጉላት ብቻ ይከሰታል። በጣም ምቹ በሆነ ሁኔታ፣ ክፋዮቹ እርስ በእርስ ሊሞሉ ይችላሉ፣ ነገር ግን ምርቶቹ ትንሽ እና ከመለየት ደረጃዎች በታች ይሆናሉ።
(ለ) የመሠረቶች መጥፋት፣ በዋናነት በዲፑሪንሽን እና በታይሚዲን ዲመር ምስረታ ምክንያት፣ የኤች-ቦንዶች ብዛት እንዲቀንስ እና የቲኤም (Tm) እንዲቀንስ ያደርጋል። በተራዘመው የማሞቂያ ደረጃ፣ ፕሪመሮቹ ከማትሪክስ ዲ ኤን ኤ ይቀልጣሉ እና ብዙም ጥብቅ ባልሆኑ ሁኔታዎች ውስጥ እንኳን አኒል አይሆኑም።
(ሐ) አጠገቡ ያሉት የታይሚን መሠረቶች የቲቲ ዲመር ይፈጥራሉ።
በሞለኪውላር ዲያግኖስቲክስ ውስጥ በተደጋጋሚ የሚከሰት ሌላው የተለመደ ችግር ከፌኖል-ክሎሮፎርም ማውጣት ጋር ሲነጻጸር የታለሙ ኑክሊክ አሲዶች መለቀቅ ከሚጠበቀው ያነሰ ነው። በጣም ከባድ በሆኑ ጉዳዮች ላይ ይህ ከሐሰት አሉታዊ ውጤቶች ጋር ሊያያዝ ይችላል። ብዙ ጊዜ በፈላ ፈሳሽ ወይም በሴል ፍርስራሾች ኢንዛይም መፈጨት ሊቆጥብ ይችላል፣ ነገር ግን ይህ ዘዴ ብዙውን ጊዜ በቂ ያልሆነ የኒውክሊክ አሲድ ልቀት ምክንያት ዝቅተኛ የPCR ትብነት ያስከትላል።

በማጉላት ወቅት የፖሊሜዝ እንቅስቃሴን መከልከል

በአጠቃላይ፣ እገዳው ወደ ዝቅተኛ የ PCR ውጤቶች የሚያመሩትን ሁሉንም ምክንያቶች ለመግለጽ እንደ መያዣ ጽንሰ-ሀሳብ ጥቅም ላይ ይውላል። በጥብቅ ባዮኬሚካላዊ አገባብ፣ እገዳው በኢንዛይም እንቅስቃሴ ላይ የተገደበ ነው፣ ማለትም፣ ከዲኤንኤ ፖሊሜሬዝ ወይም ከኮፋክተሩ ንቁ ቦታ ጋር መስተጋብር በመፍጠር የንጥረ-ምርት ልወጣን ይቀንሳል ወይም ይከላከላል (ለምሳሌ፣ ለ Taq DNA polymerase Mg2+)።
በናሙናው ውስጥ ያሉ ክፍሎች ወይም የተለያዩ ቋቶች እና ሬጀንቶችን የያዙ ተዋጽኦዎች ኢንዛይሙን በቀጥታ ሊገቱ ወይም ተባባሪ ፋክተሮችን (ለምሳሌ EDTA) ሊያጠምዱ ይችላሉ፣ በዚህም ፖሊሜሬዝን ያቆማሉ እና በተራው ደግሞ የፒሲአር አሉታዊ ውጤቶችን ይቀንሳሉ ወይም ሐሰት ይሆናሉ።
ይሁን እንጂ፣ በምላሽ ክፍሎች እና በዒላማ ባላቸው ኑክሊክ አሲዶች መካከል ያሉ ብዙ ግንኙነቶች 'PCR አጋቾች' ተብለውም ተመድበዋል። የሴሉ ታማኝነት በመነጠል ከተበላሸ እና ኑክሊክ አሲድ ከተለቀቀ በኋላ፣ በናሙናው እና በዙሪያው ባለው መፍትሄ እና በጠጣር ደረጃ መካከል ያለው መስተጋብር ሊከሰት ይችላል። ለምሳሌ፣ 'አቃቂዎች' ነጠላ ወይም ድርብ-ክር ያለው ዲ ኤን ኤ ባልተቀላቀለ መስተጋብር በኩል በማሰር እና በመጨረሻም ወደ PCR ምላሽ ዕቃ የሚደርሱትን ኢላማዎች ብዛት በመቀነስ በማግለል እና በማጽዳት ላይ ጣልቃ ሊገቡ ይችላሉ።
በአጠቃላይ፣ PCR አጋቾች በአብዛኛዎቹ የሰውነት ፈሳሾች እና ለክሊኒካዊ የምርመራ ምርመራዎች (በሽንት ውስጥ ዩሪያ፣ በደም ውስጥ ሂሞግሎቢን እና ሄፓሪን)፣ የአመጋገብ ማሟያዎች (ኦርጋኒክ ክፍሎች፣ ግላይኮጅን፣ ስብ፣ Ca2+ ions) እና በአካባቢ ውስጥ ባሉ ክፍሎች (ፌኖል፣ ከባድ ብረቶች) ውስጥ ይገኛሉ።

በብዛት የሚገኙት የPCR አጋቾች በባክቴሪያ እና በዩካርዮቲክ ሴሎች፣ ኢላማ ባልሆኑ ዲኤንኤዎች፣ በቲሹ ማትሪክስ ዲኤንኤ-ማሰር ማክሮሞለኪውሎች እና እንደ ጓንት እና ፕላስቲኮች ባሉ የላቦራቶሪ መሳሪያዎች ውስጥ ይገኛሉ። በማውጣት ጊዜ ወይም በኋላ የኒኩሊክ አሲዶችን ማጽዳት የPCR አጋቾችን ለማስወገድ ተመራጭ ዘዴ ነው።
ዛሬ፣ የተለያዩ አውቶማቲክ የማውጣት መሳሪያዎች ብዙ በእጅ የሚሰሩ ፕሮቶኮሎችን ሊተኩ ይችላሉ፣ ነገር ግን 100% የዒላማዎች መልሶ ማግኛ እና/ወይም ማጽዳት እስካሁን አልተሳካላቸውም። ሊሆኑ የሚችሉ አጋቾች አሁንም በተጣራው ኑክሊክ አሲዶች ውስጥ ሊኖሩ ይችላሉ ወይም ቀድሞውኑ ተግባራዊ ሊሆኑ ይችላሉ። የአጋቾችን ተጽእኖ ለመቀነስ የተለያዩ ስልቶች አሉ። ተገቢውን ፖሊሜሬዝ መምረጥ በአጋቾች እንቅስቃሴ ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል። የPCR መከላከያን ለመቀነስ የተረጋገጡ ሌሎች ዘዴዎች የፖሊሜሬዝ ክምችት መጨመር ወይም እንደ BSA ያሉ ተጨማሪዎችን መተግበር ናቸው።
የ PCR ግብረመልሶችን መከልከል የውስጥ ሂደት ጥራት ቁጥጥር (IPC) በመጠቀም ሊረጋገጥ ይችላል።
እንደ ኤታኖል፣ EDTA፣ CETAB፣ LiCl፣ GuSCN፣ SDS፣ አይሶፕሮፓኖል እና ፊኖል ያሉ በማውጣት ኪት ውስጥ ያሉትን ሁሉንም ሪጀንቶች እና ሌሎች መፍትሄዎችን በጥንቃቄ በማጠብ ከኒውክሊክ አሲድ ለይቶ ለማውጣት ጥንቃቄ መደረግ አለበት። እንደ ትኩረታቸው መጠን፣ PCRን ሊያነቃቁ ወይም ሊገቱ ይችላሉ።